近日，中国体育彩票大学附属妇产科医院华克勤教授团队联手附属妇产科医院张锋教授团队、中科院上海生化与细胞研究所李劲松教授团队，提出并证明了“GEN1+WNT9B”双基因突变的协同叠加效应是导致女性苗勒管发育不良的重要原因。10月18日，研究成果以“Joint utilization of genetic analysis and semi-cloning technology reveals a digenic etiology of Müllerian anomalies”为题，在线发表于《细胞研究》（Cell Research，IF=17.8）。
来自临床的诉求：有否实现源头杜绝的可能
女性苗勒管发育不良是子宫、宫颈、引道等女性生殖系统发育畸形或缺陷的统称，常合并泌尿系统发育异常，是一种复杂的先天性疾病。华克勤指出，临床上，女性苗勒管发育不良患者表现为严重程度不一的生殖系统形态结构异常，无子宫无阴道、单角子宫、残角子宫、宫颈阴道闭锁等等都属于女性苗勒管发育不良。该疾病听起来陌生，事实上并非罕见。其中，仅阴道发育异常，临床上有文献报道的发生率就占出生女孩数高达1/4500。女性苗勒管发育异常严重影响了青少年女性的身心健康和发育成长，并且对该人群长期的健康与生活带来系列问题。
近十年来，华克勤团队已为100余例女性生殖道畸形患者进行了微创整复技术，曾完成国际首例腹腔镜下单角和残角子宫融合，成全了患者为人之母的心愿；也曾创新性地使用生物网片及自体组织来代宫颈代阴道，全维度的考虑患者隐私、经济承受力以及生理心理需求。
尽管很多女性经过治疗取得了满意的疗效，但疾病带来的身心创伤在很大程度上往往弥久难愈。既然女性苗勒管发育异常是一项先天性的疾病，那么能否将防控的关口前移，从源头入手杜绝苗勒管发育不良的可能呢？
强强联合，临床与科研的完美碰撞
临床需求往往是基础研究灵感与驱动力的源泉，而基础研究的成果一旦有效转化入临床实践往往也能为临床提供全新的诊疗思路，甚至于创造性地改变疾病的治疗路径。多年来，世界各国研究人员一直都在积极尝试寻找女性苗勒管发育不良的遗传致病机制，国内外学者们已发现许多基因可能参与苗勒管的发育，这些基因也被列为导致该疾病的候选基因。
然而对于复杂人类疾病来说，单基因突变通常很难解释疾病的发生。探究该疾病双基因还是寡基因模式迫在眉睫。为此，华克勤团队联合张锋团队和李劲松团队，共同对女性苗勒管发育不良问题开展了研究。张锋一直致力于人类基因组拷贝数变异等遗传变异及其致不孕不育、出生缺陷等疾病的基础和转化研究。李劲松曾建立了精子来源的单倍体胚胎干细胞，并将其与CRISPR-Cas9基因编辑技术相结合，实现了建立模拟人类疾病的小鼠模型、在体筛选决定胚胎发育的关键基因、在体筛选决定蛋白质功能的关键氨基酸、开展基因组标签计划等。三支顶尖队伍强强联合，对女性苗勒管发育不良共同展开了深入研究。
抽丝剥茧，致病基因水落石出
本次研究基于华克勤团队收集的125例苗勒管发育不良的患者血液样本并展开进一步的表型分型。张锋团队利用实时定量PCR技术（qPCR）、全基因组杂交芯片进行了样本分析，发现9例携带有罕见的基因组拷贝数变异（copy number variants, CNVs）。
双/寡基因突变导致MA的模式图
据张锋介绍，在家系遗传分析中，其团队发现部分患者的母亲携带相应的CNV。这些结果提示单一的遗传变异不足以导致苗勒管发育不良。研究人员进一步利用全外显子测序技术对上述9例CNV携带者进行了全外显子测序，发现其中1例GEN1/2p24.2缺失患者还携带有WNT9B基因突变、1例TBX6/16p11.2缺失患者还携带有GATA3基因突变。由此推测“GEN1+WNT9B”、“TBX6+GATA3” 2个突变组合可能是导致人类女性苗勒管发育不良的致病原因。
为了更科学、有利的验证女性苗勒管发育不良的双基因致病性，李劲松课题组利用半克隆技术结合CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了模拟人类疾病的多基因突变小鼠模型。值得一提的是，该团队此次是世界首次应用半克隆技术和CRISPR-Cas9基因编辑技术针对MA开展实验研究。
半克隆技术结合CRISPR-Cas9快速制备双/寡基因突变小鼠的流程图
研究中，团队利用半克隆技术、CRISPR-Cas9基因编辑技术快速构建了“Gen1+Wnt9b”、“Tbx6+Gata3”双突变小鼠模型。通过分析发现，“Gen1+Wnt9b”突变组合可以导致小鼠苗勒管发育不良。在MA家系和小鼠模型中，GEN1或WNT9B单基因突变都不足以致病，但是两个基因突变的叠加则具有致病性。该实验模型结果证明了“GEN1+WNT9B”双基因突变组合是导致MA的致病原因之一。
该研究成果为遗传咨询和筛查提供了重要的理论指导。据悉，未来团队将搜寻更多的致病性基因突变组合，为将来生殖道畸形患者接受辅助生殖技术，提供精准的胚胎移植前基因诊断和指导，为该项遗传病的生殖阻断提供更多科学证据，从基因层面指导优生优育，助力“健康中国”战略。
（封面制图：王木木）
